一、任務目的

·；熟悉利用低溫、干燥、缺氧等進行菌種保藏的原理。

·；掌握菌種常用保藏技術。

二、任務原理

保藏菌種一般以試管的形式進行保存。菌種保藏的基本原理是盡可能地降低菌絲的生理代謝活動，使生命活動處于休眠狀態，從而達到菌種保藏的目的。通常采用干燥、低溫、冷凍及缺氧、真空等手段進行菌種保藏。

三、材料與儀器

母種試管、PDA試管斜面，麥粒、液狀石蠟（裝入三角瓶中，經高壓蒸汽滅菌后，40℃干燥箱烘干水分后備用）、濾紙條（裝入培養皿中經1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌后備用）、滅菌插菇鐵絲架、無菌帶棉塞空試管、超凈化工作臺、接種用具、無菌鑷子、固體石蠟、坩堝、酒精燈、試管架、塑料薄膜、牛皮紙、捆扎繩、標簽、普通冰箱等。

四、任務實施

1.斜面低溫保藏法

將保藏的母種接入PDA斜面培養基中，待菌絲長至斜面的2/3時，選擇菌絲生長粗壯整齊的母種試管，將試管口的棉塞用剪刀剪平。利用酒精燈在坩堝里溶化固體石蠟，用于密封試管口，在外包扎一層塑料薄膜，后將試管斜面朝下放入4℃冰箱里保存。有效保藏期一般為3～6個月，好在2～3個月時轉管。如用無菌膠塞封口的菌種，在冰箱中可保藏3年之久，仍具有很強的生活力。保藏的菌種在使用時應提前12～24h從冰箱中取出，經過適溫后恢復活力方能轉管。

2.麥粒培養基保藏法

選擇顆粒飽滿、新鮮、無病蟲害的小麥粒，用清水浸泡10h左右，濾干后分裝入試管，容量為試管長度的1/3，塞好棉塞，在1.05kg/cm2壓力下滅菌1h，28℃培養24h后，再在1.05kg/cm2壓力下滅菌1h。在無菌操作下，將要保藏的菌種接入滅菌好的麥粒培養基內。在25℃下培養，菌絲長滿培養基后，在無菌操作下換上無菌膠塞并蠟封，放入4℃左右冰箱內保藏。使用時，在無菌操作下，將每支斜面培養基中央接入少量麥粒，培養至菌絲長滿斜面即可。采用麥粒培養基作為保藏菌種的培養基，可保藏菌種1年以上。

3.液狀石蠟保藏法

將需要保存的菌種接到培養基上，好用綜合馬鈴薯瓊脂培養基，在適溫下培養至菌絲長滿斜面。然后把液狀石蠟裝于三角瓶中，裝至瓶體1/3處，塞上棉塞，并包紙，另將10mL試管若干支也包裝好，在1.05kg/cm2壓力下滅菌1h，再放入100℃烘箱內干燥1h，以蒸發其中水分，至石蠟油完全透明為止。將處理好的石蠟油移接到空白斜面上，在28～30℃下培養2～3d，證明無雜菌生長方可使用。然后用無菌操作的方法把液狀石蠟注入待保藏的斜面試管中。注入量以高出培養基斜面1～1.5cm，塞上橡皮塞，用固體石蠟封口，直立于低溫干燥處保藏。保藏時間在一年以上，在低溫下，保藏時間還可延長。

五、實驗報告

（1）結果分析　分析菌種保藏存活率低的原因。

（2）問題討論　觀察結果并對出現的問題進行分析、討論。